MPXV PCR Monkeypox Virus Wielokrotne wykrywanie PCR w czasie rzeczywistym

Procedura operacyjna

1) Ekstrakcja kwasu nukleinowego Ekstrakcja DNA z próbek za pomocą odpowiedniego zestawu ekstrakcyjnego.Zaleca się, aby kwas nukleinowy był elutowany w ostatnim etapie ekstrakcji około 100 μl bufora elucyjnego (TE lub H2O wolnego od nukleaz).Oczyszczony kwas nukleinowy należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20°C.

2) Preparat kontroli pozytywnej Kontrola pozytywna może być przechowywana w temperaturze otoczenia przed rehydratacją przez okres do 12 miesięcy.Przed użyciem należy go nawodnić, dodając 250 μl bufora TE lub H2O wolnego od nukleaz, wiruje przy niskiej prędkości przez 15-20 sekund i odśrodkowuje przy niskiej prędkości przez 15-20 sekund.

3) Przygotowanie mieszaniny RT-PCR w czasie rzeczywistym

A) Otwórz opakowanie próżniowe i wyciągnij 8-rurowe taśmy zawierające odczynnik.Jeśli dostarczone rurki nie są kompatybilne z przyrządem, przenieść peletę odczynnika do rurki optycznej zgodnej z przyrządem.

B) Otwórz rurki i wyrzuć pokrywkę (nie nadaje się do maszyn PCR w czasie rzeczywistym) i przygotuj mieszankę reakcyjną na lodzie, jak poniżej

* Woda wolna od nukleaz może być stosowana jako kontrola negatywna.

C) Zamknij rurki pokrywkami optycznymi lub 96-dołkową płytką z optyczną folią uszczelniającą (nie dostarczona).

D) Wrzucić rurki z niską prędkością przez 10 ~ 15 sekund, i odśrodkować przy 3000 obr./min przez 20 sekund i umieścić je w przyrządzie PCR w czasie rzeczywistym.

3) Ustawienie RT-PCR: ustawić objętość reakcji na 25μl i procedurę wzmacniania PCR zgodnie z poniższym.Fluorescencja ROX (dla Orf1ab) i CY5 (dla genu RNasa P) w temperaturze 60°C, a następnie wybrać NONE jako pasywne odniesienie.
4) Analiza i interpretacja wyników Ustawić linię progu zgodnie z instrukcjami przyrządu.

A) Kontrola jakości:

B) Interpretacja wyników próbki

Parametry techniczne: