Zestaw testowy Elisa przeciwko peroksydazie tarczycy Zestawy testowe przeciwciał przeciwko TPO

Zestaw Elisa anty-TPO anty-peroksydaza tarczycy

1. Przeznaczenie

Test immunologiczny do ilościowego oznaczania in vitro przeciwciał przeciwko peroksydazie tarczycowej w ludzkiej surowicy.Oznaczenie anty-TPO jest stosowane jako pomoc w diagnostyce autoimmunologicznych chorób tarczycy.

2. Podsumowanie 

• Peroksydaza swoista dla tarczycy (TPO) jest obecna na mikrosomach tyrocytów i ulega ekspresji na ich wierzchołkowej powierzchni komórek.W synergii z tyreoglobuliną (Tg) enzym ten pełni zasadniczą funkcję w jodowaniu L-tyrozyny i sprzęganiu chemicznym powstałej mono- i di-jodotyrozyny w hormony tarczycy T4, T3 i fT3.
• TPO jest potencjalnym autoantygenem.Podwyższone miana przeciwciał przeciwko TPO w surowicy stwierdza się w: kilka postaci zapalenia tarczycy wywołanych autoimmunizacją.Wciąż często spotykany termin „przeciwciało mikrosomalne” pochodzi z czasów, gdy TPO nie został jeszcze zidentyfikowany jako antygen w autoimmunizacji wywołanej przez mikrosomy.W sensie klinicznym oba terminy przeciwciało anty-TPO i przeciwciało mikrosomalne mogą być używane jako synonimy;istnieją jednak różnice w metodach badawczych.
• Wysokie miana anty-TPO stwierdza się nawet u 90% pacjentów z przewlekłym zapaleniem tarczycy Hashimoto.W chorobie Gravesa-Basedowa 70% pacjentów ma podwyższone miano.Chociaż czułość zabiegu można zwiększyć poprzez jednoczesne oznaczenie innych przeciwciał przeciwtarczycowych (anty-Tg, TSH-przeciwciało-przeciwciało - TRAb), wynik ujemny nie wyklucza możliwości choroby autoimmunologicznej.Wielkość miana przeciwciał nie koreluje z kliniczną aktywnością choroby.Początkowo podwyższone miana mogą stać się ujemne po długich okresach choroby lub podczas remisji.Jeśli przeciwciała pojawią się ponownie po remisji, prawdopodobny jest nawrót.
• Podczas gdy zwykłe testy przeciwciał mikrosomalnych wykorzystują nieoczyszczone mikrosomy jako preparat antygenowy, testy anty-TPO wykorzystują oczyszczoną peroksydazę.Obie procedury mają porównywalne wyniki pod względem czułości klinicznej, ale ze względu na wyższą jakość użytego antygenu można oczekiwać lepszej spójności między seriami i wyższej swoistości klinicznej od testów anty-TPO.Testy immunoabsorpcji enzymatycznej wykorzystują ludzki antygen i królicze przeciwciała anty-ludzkie IgG (anty-IgG).

3. Zasada testu

Metoda pośrednia, całkowity czas trwania testu: 70 minut.

Test Anti-TPO ELISA wykorzystuje pośrednią metodę ELISA w fazie stałej do wykrywania przeciwciał przeciwko TPO w dwuetapowej procedurze inkubacji.Polistyrenowe paski z mikrostudzienkami są wstępnie pokryte wysoce immunoreaktywnymi ludzkimi antygenami TPO.Podczas pierwszego etapu inkubacji, przeciwciała anty-TPO, jeśli są obecne, będą wiązane do wstępnie pokrytych antygenami TPO w fazie stałej.Studzienki przemywa się w celu usunięcia niezwiązanych białek surowicy i dodaje się królicze przeciwciała anty-ludzkie IgG (anty-IgG) sprzężone z enzymem peroksydazy chrzanowej (koniugat HRP).Podczas drugiego etapu inkubacji te przeciwciała skoniugowane z HRP będą wiązane z dowolnymi wcześniej utworzonymi kompleksami antygen-przeciwciało (IgG), a niezwiązany koniugat HRP jest następnie usuwany przez płukanie.Roztwory chromogenu zawierające tetrametylobenzydynę (TMB) i nadtlenek mocznika są dodawane do dołków iw obecności kompleksu immunologicznego antygen-przeciwciało-anty-IgG (HRP), bezbarwne chromogeny są hydrolizowane przez związany koniugat HRP do produktu o niebieskim zabarwieniu.Niebieski kolor zmienia się na żółty po zatrzymaniu reakcji kwasem siarkowym.

Można zmierzyć intensywność koloru i jest ona proporcjonalna do ilości przeciwciała wychwyconego w studzienkach oraz odpowiednio do ilości przeciwciała w próbce.

4. Odczynniki Dostarczone materiały

• Powlekana mikropłytka, 8 x 12 pasków, 96 dołków.Wstępnie pokryty ludzkim antygenem TPO.

• Kalibratory, 6 fiolek po 1 ml każda, gotowe do użycia;Stężenia: 0(A), 25(B),50(C), 100(D), 250(E) i 500(F) IU/ml.

• Koniugat enzymu, 1 fiolka, 11,0 mL znakowanych HRP (peroksydaza chrzanowa) króliczych przeciwciał anty-ludzkich IgG (anty-IgG) w buforze Tris-NaCl zawierającym BSA (albumina surowicy bydlęcej).Zawiera 0,1% konserwant ProClin300.

• Rozcieńczalnik surowicy: 1 fiolka, 11 ml.Zawiera sole buforujące i barwnik

• Koncentrat roztworu do płukania, 1 fiolka, 25 ml (stężony 40X), roztwór do płukania PBS-Tween.

• Substrat, 1 fiolka, 11 ml, gotowy do użycia, (tetrametylobenzydyna) TMB.

• Roztwór zatrzymujący, 1 fiolka, 6,0 ml 1 mol/l kwasu siarkowego.

• IFU, 1 kopia.

• Pokrywa talerza: 2 sztuki.

Wymagane materiały (ale nie dostarczone)

• Czytnik mikropłytek o zdolności pochłaniania fal 450nm i 620nm.

• Myjka do mikropłytek.

• Inkubator.

• Wytrząsarka do talerzy.

• Mikropipety i mikropipety wielokanałowe dostarczające 50 µl z dokładnością lepszą niż 1,5%.

• Papier chłonny.

• Woda destylowana

5. Procedura testowa

• Należy używać tylko wymaganej liczby dołków i sformatować dołki mikropłytki dla każdego kalibratora i próbki, która ma być oznaczona.

• Dodaj 100 µl kalibratorów do każdego dołka.

• Dodaj 100 µl rozcieńczalnika do próbek (kolor zielony) do każdego dołka z wyjątkiem dołków kalibratora.

• Dodaj 10 µL próbki do każdego dołka rozcieńczalnika próbki (UWAGA: Odczynniki w dołkach zmienią kolor na niebieski z zielonego), a następnie wstrząsaj przez 30 sekund.

• Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj w 37 °C przez 30 minut.

• Wyrzucić zawartość mikropłytki przez dekantację lub aspirację.Jeśli dekantujesz, postukaj i osusz płytkę chłonnym papierem.

• Dodać 350 µl roztworu do płukania, zdekantować (ostukać i osuszyć) lub zaaspirować.Powtórz 4 dodatkowe razy, w sumie 5 prań.Pod koniec mycia odwrócić płytkę i wytrzepać resztki roztworu myjącego na bibułę chłonną.

• Dodaj 100 µL koniugatu enzymu,

• Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj w 37 °C przez 30 minut.

• Dodać 350 µl roztworu do płukania, zdekantować (ostukać i osuszyć) lub zaaspirować.Powtórz 4 dodatkowe razy, w sumie 5 prań.Pod koniec mycia odwrócić płytkę i wytrzepać resztki roztworu myjącego na bibułę chłonną.

• Dodaj 100 µl substratu do każdego dołka.Przykryj i inkubuj w temperaturze otoczenia (18-25℃) w ciemności do reakcji przez 10 minut.Nie wstrząsać płytki po dodaniu substanu.

• Dodaj 50 µl roztworu zatrzymującego reakcję do każdego dołka.

• Wstrząsaj przez 15-20 sekund, aby wymieszać płyn w dołkach.Ważne jest, aby kolor niebieski zmienił się całkowicie na żółty.

• Odczytaj absorbancję każdego dołka przy 450 nm (stosując 620 do 630 nm jako referencyjną długość fali w celu zminimalizowania niedoskonałości dołków) w czytniku mikropłytek.Wyniki należy odczytać w ciągu 30 minut od dodania roztworu zatrzymującego.